空氣負氧離子抑制肝癌細胞的實驗研究

—關于森肽基生態(tài)級負氧離子生成機的實驗研究

陶名章^1*，李慧²，陳少周³，李海濤⁴

（1．中國空氣負離子暨臭氧研究學會，廣州510300；2. 南方醫(yī)科大學附屬南方醫(yī)院呼吸睡眠中心，廣州510516;3.香港瑪麗醫(yī)院精神科，香港999077；4.中山大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣州510080）

【摘要】目的 研究空氣負氧離子對肝癌hepa1-6細胞生物活性的影響。方法 把細胞隨機分為3組：空白對照組，空氣對照組和負氧離子治療組。治療組根據(jù)負氧離子作用時間分為1h組、2h組和4h組。對細胞進行tunel染色檢測凋亡情況，流式細胞儀檢測細胞周期變化情況，以westernblot法檢測磷酸化p38mapk的表達變化。結果 與空白對照組和空氣對照組比較, 空氣負氧離子治療組肝癌細胞凋亡率明顯增加,處于s期肝癌細胞所占有的比例下降明顯, 磷酸化p38mapk 表達上升明顯, 差異均具有統(tǒng)計學意義(p < 0.05)。結論 空氣負氧離子通過阻滯細胞周期使腫瘤細胞發(fā)生凋亡, 進而抑制腫瘤細胞，該效應是通過p38mapk信號通路傳導來實現(xiàn)的。

【關鍵詞】空氣負氧離子，空氣負離子，肝癌，p38mapk

study of negative oxygen ions inhibiting liver cancer cells in vitro

tao ming-zhang¹，li hui²,chen shao-zhou³,li hai-tao⁴

(1.china on negative air ions and ozone reseach society，guangzhou 510300，china；2. center of respiration and sleep，nanfang hospital affiliated nanfang medical college，guangzhou 510516，china；3. department of psychiatry，hongkong queen mary hospital，hongkong 999077，china；4. department of neurology，first hospital affiliated sun yat-sen university，guangzhou 510080，china )

【abstract】objective：to investigate the affect on the biologic activity of hepatoma hepa1-6 cell line of negative oxygen ions in vitro. methods dividing the cell into three groups: negative control group, air control

group and treatment group，randomly.dividing the treatment group into 1h、2h and 4h group according to action time of negative oxygen ions, all the cells in each group were detected apoptosis and cell cycle with flow cytometry method, the phospho- p38mapk expression was detected.

by westernblot assay. results：the apoptosis rate increased, the proportion of s stage cell decreased and the expression of phospho- p38mapk increase obviously vs negative and air control group, the difference show significance ( p < 0.05).

conclusion：the negative oxygen ions can induce hepatoma hepa1-6 cell apoptosis through arresting the cell cycle, such effect was mediated by p38mapk pathway.

key words: negative oxygen ions; negative air ions; hepatoma; p38mapk

被譽為空氣維生素的空氣負氧離子對人體健康十分有益。研究表明，它能有效調(diào)整大腦皮層的功能，有鎮(zhèn)靜、催眠及降血壓作用；它能使支氣管平滑肌松弛，解除其痙攣，有效緩解哮喘；它還可以降低血脂水平，提高機體免疫力及抗腫瘤作用等^[1-4]。目前大多數(shù)研究集中于流行病學方面的研究，而對于抗腫瘤和及其作用機理的研究很少。本實驗就空氣負氧離子對體外肝癌細胞的影響進行了系列研究。

1. 材料與方法

1.1 材料

肝癌細胞株hepa1-6（上海艾研生物科技有限公司）；碘化丙啶（美國sigma 公司）；tunel細胞凋亡檢測試劑盒（德國boehringer mannheim公司）；鼠抗人單克隆抗體p38mapk和p38mapk 特異性抑制劑sb203580（美國on-cogene公司），sb203580 使用終濃度為50μmol/l；森肽基生態(tài)級負氧離子生成機（濟南新活電器公司）；model ic-2000型空氣負離子檢測器（瑞典，空氣負離子檢測裝置）。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組

把處于對數(shù)生長期的肝癌細胞hepa1-6隨機分成3組, 即空白對照組、空氣對照組及負氧離子治療組。治療組根據(jù)空氣負離子作用時間分成1h組、2h組和4h組。對照組處理：孵箱中給予普通空氣；空氣負氧離子組：將孵箱改造成相對密閉的空間,通過自制的裝置輸入由森肽基生態(tài)級負氧離子生成機產(chǎn)生的空氣負氧離子,同時應用空氣離子檢測器來檢測空氣負離子濃度, 在實驗前保證空氣負氧離子濃度不高于500 /cm3,電離后維持空氣負氧離子濃度在( 2- 3)×106 /cm3。

1.2.2 tunel染色

胰蛋白酶消化5-10代肝癌細胞, 制成密度為10⁵/ml左右的細胞懸液。加細胞懸液于蓋玻片上, 4h后細胞貼壁, 添加培養(yǎng)基。待細胞生長達50%-60%, 用無血清dmem 培養(yǎng)液洗2次, 再加條件培養(yǎng)液, 繼續(xù)培養(yǎng)48h, 收集蓋玻片并應用4% 多聚甲醛固定,爬片制作成功后按照以下步驟染色: ⑴梯度乙醇水化; ⑵3ml/l h₂o₂封閉30min; ⑶20mg/l蛋白酶k消化液作用20min; ⑷tunel反應液, 37℃孵育60min; ⑸過氧化物酶連接的抗熒光素抗體, 37℃孵育30min;注意：以上2-5步以后均以10mmol/l pbs( ph7.4)輕輕振洗3次, 每次5min; ⑹dab 顯色, 蘇木素復染, 脫水透明, 封片。以pbs 替代tunel反應液作陰性對照, 陽性對照爬片經(jīng)dnaseⅠ預處理10min, 再接tunel染色步驟。結果判定: 光鏡下觀察tunel染色爬片的顯色反應, 數(shù)5個以上高倍視野, 不少于1000個細胞, 重復5次。細胞核中有棕黃色顆粒者為tunel陽性細胞, 即凋亡細胞。記數(shù)陽性細胞數(shù)并以百分數(shù)表示, 作為細胞凋亡指數(shù)。

1.2.3 應用流式細胞儀進行細胞周期分析 收集消化的貼壁細胞, pbs 沖洗后重懸在4℃、70%的乙醇中1-2h, 以1000r/min離心細胞后重懸在含100mg/l rna 酶和10mg /l碘化丙啶的pbs中,在25℃避光孵育15min。用facscalibur流式細胞儀進行單色熒光細胞流式計數(shù)。結果用multiplus software軟件分析數(shù)據(jù), 每個樣本收集10000個細胞, 重復3次。

1.2.4 westernblot方法檢測空氣負離子作用前后磷酸化p38mapk 的蛋白表達 取體外培養(yǎng)的10⁷~10⁸個hepa1-6細胞在1ml ripa裂解緩沖液中勻漿提取蛋白, 測定提取的蛋白濃度。每個上樣孔加樣30μg蛋白, 經(jīng)電泳、轉膜后雜交, 一抗為山羊抗人磷酸化p38mapk單抗( santa cruz公司, 1：400), 二抗為hrp標記兔抗山羊igg抗體( santa cruz公司, 1：4000) , ecl顯色( amersham公司) , 拍照, 密度掃描測各條帶吸光度( ia )。以ia (目的條帶/β-actin對照條帶) , 表達各標本上述蛋白含量, 重復10次。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用spss13.0軟件進行統(tǒng)計學分析, 計量資料用(

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